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MOTIVACIÓN Neuronas de hipocampo de rata en cultivo sobre las que hacen sinapsis axones de otras neuronas del mismo cultivo que sobre expresan sinaptofluorina en botones sinápticos (puntos más brillantes)
ABORDAJE Medida de la capacitancia de la membrana plasmática Amperometria en células únicas Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Total Interna (TIRFM) Transfección estable de cultivos celulares con proteinas marcadas con GFP y que participan en la exocitosis y la endocitosis. ANTECEDENTES Estudiamos la exocitosis y la endocitosis con técnicas electrofisiológicas de alta resolución, la técnica de patch clamp y la amperometría. Estas dos técnicas permiten resolver la fusión de vesículas únicas en células neuroendocrinas con una resolución temporal de milisegundos. Gracias al uso combinado de estos dos métodos hemos podido observar, por primera vez en la literatura, los fenómenos básicos que acontecen desde que se produce la fusión de una vesícula secretora con la membrana plasmática y el curso temporal de la liberación de transmisores al espacio extracelular. Los datos obtenidos en nuestro laboratorio en los últimos anos han demostrado que la exocitosis no es un fenómeno irreversible, sino que puede ser transitorio. Estos resultados han demostrado que el "flicker" observado en 1984 por Fernández, Neher y Gomperts es un fenómeno con implicaciones fisiológicas, en contra de lo establecido por la comunidad científica hasta ese momento. Con estos experimentos demostramos un nuevo mecanismo celular básico para la liberación de neurotransmisores, es decir, que una vesícula secretora puede liberar parte de su contenido a través de la apertura inicial (poro de fusión) que se establece entre el interior vesicular y el espacio extracelular cuando se produce la fusión de membranas durante la exocitosis. Nuestros resultados reactivaron la discusión sobre el mecanismos de liberación de neurotransmisores que hubo en la década de los 70 a los 80, donde dos hipótesis distintas se postularon para el liberación cuántica de neurotransmisores. Hipótesis Clásica de Heuser y Reese para el reciclado de vesículas sinápticas El mecanismo clásico y ampliamente aceptado acerca del mecanismo de reutilización de las vesículas sinápticas sostiene que, ante la llegada de un potencial  de acción al terminal sináptico y la entrada de iones de calcio a través de canales voltaje dependientes, una vesícula se funde completamente con la membrana plasmática, liberando su contenido cuántico al espacio sináptico. Después de la fusión se produce la incorporación completa de la membrana vesicular en la membrana presináptica, la cual es introducida al citosol mediante endocitosis mediada por vesículas revestidas de clatrina en zonas laterales a la zona activa.Hipótesis alternativa de Ceccarelli et al.  La hipótesis alternativa de Ceccarelli et al. establece que la mayor parte de la liberación de neurotransmisor se produce por la fusión transitoria de vesículas sinápticas con la membrana plasmática. La incorporación completa de la membrana vesicular con la membrana presináptica se produce únicamente después de que se haya utilizado y recargado en varias ocasiones una vesícula sináptica dentro del propio terminal. Esta hipótesis es energéticamente más económica para la neurona. |
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